Цель методики
Окрашивание по Цилю-Нильсену используется в микроскопии и бактериологии для выявления микобактерий, в частности, Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis , которая клинически вызывает туберкулез. Однако не стоит недооценивать и другие виды, которые встречаются реже, чем M. туберкулеза, но тем не менее являются высокопатогенными, например Mycobacterium leprae , Mycobacterium kansasii , Mycobacterium bovis , Mycobacterium africanum и все те, которые принадлежат к комплексу Mycobacterium avium .
Вместе с флюорохромным окрашиванием аурамином этот метод является методом выбора для подтверждения любых патологий микобактериальной этиологии.
Микобактерии, из-за конформации их клеточной стенки, богатой липидами и восками, считаются устойчивыми к спиртовым кислотам и поэтому требуют дополнительных шагов и более специфических методов для микроскопической идентификации, в отличие от других микроорганизмов.
Что это такое и как это работает
Это окрашивание названо в честь двух немецких врачей: микробиолога Франца Циля и патолога Фридриха Неельсена . Он также известен как » горячий карболфуксин «: карболфуксин является основным красителем, который сохраняют микобактерии, и проводится горячим способом, так как перед окрашиванием предметное стекло обязательно должно быть нагрето над пламенем.
Входит в диапазон дифференциального окрашивания и контрастного окрашивания , при котором используется более одного вещества, с которым будут связываться микобактерии (и, если присутствуют, другие популяции бактерий, кроме этих). Дифференциальные красители, обычно используемые в качестве вторичных красителей, всегда позволяют различать другие микроорганизмы, нежели те, которые мы ищем.
Первичным красителем , как упоминалось выше, является карболфуксин , а вторичным красителем почти всегда является метиленовый синий . В других методах, однако, мы можем найти малахитовый зеленый .
В конце окрашивания микобактерии, которые не обесцвечиваются кислотно-спиртовой смесью, поглощают карболфуксин и появляются под микроскопом в виде маленьких бацилл фуксиево-красного цвета. И наоборот, любая дополнительная популяция бактерий, кроме предыдущей, которая подвергается обесцвечиванию, будет видна как синий фон, поскольку она будет поглощать метиленовый синий.
Необходимые материалы
- предметное стекло микроскопа, на которое помещается анализируемый биологический материал, предварительно зафиксированный;
- Основной фенилированный фуксин Циля (карболфуксин): Приготовьте раствор, содержащий 0,3 г основного фуксина в 10 мл 95% этанола. Также растворите 5 г кристаллизованного фенола в 100 мл дистиллированной воды и смешайте 10 мл раствора фуксина с 90 мл водного раствора фенола. Последний добавляется в качестве протравителя;
- Обесцвечиватель: Добавьте 3 мл концентрированной соляной кислоты к 97 мл 95% этанола.
- Метиленовый синий (контрастный краситель): Растворите 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.
Процедура
- Полностью покройте предметное стекло карболфуксином Циля. Нагревайте медленно, до образования первых паров, пропуская под предметным стеклом пламя ватного шарика, смоченного в спирте. Этот этап должен выполняться строго под химическим колпаком, так как образующиеся пары токсичны.
- умываться родниковой водой;
- обесцветить с помощью кислотно-спиртовой смеси, делая несколько проходов по 30 секунд каждый, пока в промывочной жидкости не останется следов красителя;
- снова умойтесь родниковой водой;
- добавьте контраст (метиленовый синий) по крайней мере на 30 секунд;
- промыть родниковой водой и дать высохнуть на воздухе;
- читается под оптическим микроскопом.
Наблюдение за слайдом
Считывание слайда осуществляется с помощью простого оптического микроскопа. Используемый уровень увеличения и выбор — 100-кратное иммерсионное («масло») .
Кислото- и спиртоустойчивые бациллы будут выглядеть резко красными / фуксиевыми на абсолютно синем фоне, создаваемом контрастным красителем, в котором будут присутствовать все остальные некислото- и спиртоустойчивые бактерии.
Рисунок 1 — Микобактерии под микроскопом: характерная фуксиновая окраска, придаваемая карболфуксином, делает их хорошо видимыми и отличимыми от синеватого фона.
Рисунок 2 — Оптический микроскоп, использованный для чтения слайдов
